Молекулярный механосенсор по-настоящему

Jul 31, 2023

Природная микробиология, том 8, страницы 1508–1519 (2023 г.) Процитировать эту статью

2761 Доступов

43 Альтметрика

Подробности о метриках

Грибок рисового взрыва Magnaporthe oryzae использует инфекционную клетку под давлением, называемую апрессорием, чтобы пробить жесткий проникающий штифт через кутикулу листа. Огромное внутреннее давление аппрессориума очень сложно исследовать, поэтому наше понимание клеточной механики заражения растений остается неполным. Здесь, используя флуоресцентную визуализацию времени жизни молекулярного механозонда, нацеленного на мембрану, мы количественно оцениваем изменения в натяжении мембраны у M. oryzae. Мы показываем, что экстремальное давление в аппрессории приводит к крупномасштабным пространственным неоднородностям в механике мембран, намного большим, чем те, которые наблюдались ранее в любом типе клеток. Напротив, непатогенные мутанты с дефицитом меланина демонстрируют низкое пространственно однородное мембранное натяжение. Мутант сенсорной киназы ∆sln1 демонстрирует значительно более высокое мембранное натяжение во время инфляции аппрессория, что доказывает, что Sln1 контролирует тургор во время заражения растений. Таким образом, этот неинвазивный метод визуализации живых клеток дает новое представление об огромных инвазивных силах, используемых патогенными грибами для вторжения в своих хозяев, открывая потенциал для новых стратегий лечения заболеваний.

Многие патогены растений используют специализированные инфекционные клетки, называемые аппрессориями, для заражения своих хозяев1,2,3. Апрессории облегчают проникновение патогенов в ткани хозяина и вызывают заболевание, а знаменитый эксперимент с «золотым листом» продемонстрировал способность некоторых грибковых аппрессорий прокалывать поверхность листа, используя генерацию силы, а не ферментативную активность2,4. Апрессории рисового грибка Magnaporthe oryzae (синоним Pyricleria oryzae)5 — серьезная угроза глобальной продовольственной безопасности6,7,8 — разрушают жесткую поверхность листьев риса и, что примечательно, другие твердые синтетические поверхности, генерируя тургор до 8,0. МПа (~ в 40 раз превышает давление в автомобильной шине9). Это генерирует силу у основания аппрессория, измеренную у родственного патогена Colletotrichum graminicola с использованием оптического волновода и составляющую 17 мкН (ссылка 10). Напротив, давление, измеренное в гифах грибов или оомицетов, редко превышает 0,8 МПа (ссылка 11). M. oryzae appressoria имеют выстланную меланином клеточную стенку, непроницаемую для глицерина, но свободно проницаемую для воды, которая быстро проникает в клетку, создавая гидростатическое давление. Мутация генов, кодирующих фермент биосинтеза меланина ALB1, RSY1 и BUF1, вызывает потерю меланизации аппрессориума, что обеспечивает перемещение растворенных веществ и воды через клеточную стенку аппрессориума, что приводит к потере генерации тургора и способности вызывать заболевание12,13.

Непосредственное измерение тургора аппрессориума было сложной задачей из-за огромного создаваемого давления, что не позволяет использовать датчики давления. Вместо этого исследователи использовали косвенные методы, такие как анализ начинающегося циториза, который фиксирует скорость распада клеток, когда аппрессории инкубируются в гиперосмотических растворах9,14,15. Однако мутанты с дефицитом меланина подвергаются плазмолизу, а не коллапсу клеток при воздействии высоких концентраций глицерина, что ограничивает использование этого анализа9,14. Зонд Flipper-TR, который содержит направленный на мембрану скрученный флуорофор push-pull, чувствителен к механическим силам, действующим на плазматическую мембрану. Предыдущие отчеты предположили, что время жизни флуоресценции зонда изменяется линейно с напряжением плазматической мембраны как в клетках дрожжей, так и в клетках млекопитающих16. У M. oryzae зонд использовался для измерения напряжения плазматической мембраны в гифах Guy11 и мутанте ∆vast1, который влияет на передачу сигналов TOR17 и участвует в ответе цАМФ, целостности клеток и контроле аутофагии18,19,20,21 , 22. Но, хотя исследование предполагает, что мутант ∆vast1 обладает повышенным напряжением, эксперименты проводились только на гифах23.

Здесь мы решили выяснить, можем ли мы непосредственно визуализировать генерацию тургора в аппрессориях. Недавно был разработан набор химически модифицированных молекулярных роторов для получения полных карт микровязкости клеток и тканей в цитозоле, вакуоли, плазматической мембране и стенке растительных клеток24. Эти молекулярные роторы на основе бор-дипиррометена являются ригидохромными, а это означает, что время их флуоресценции зависит от механики их окружения, такой как вязкость или натяжение мембраны. Например, зонд плазматической мембраны N+-BDP выявил различия в механике мембран между корневым чехликом растения и меристемой. Флуоресцентная микроскопия с изображением времени жизни (FLIM) показала, что меристема растения подвергается непрерывному росту и делению клеток, что приводит к постоянному напряжению в плазматической мембране24. Натяжение увеличивает расстояние между липидами, что приводит к значительному сокращению срока службы мембранного ротора по сравнению с расслабленными плазматическими мембранами клеток корневого чехлика25. Более того, более тщательное исследование плазматической мембраны выявило отдельные липидные микродомены внутри одного бислоя. Аналогично, в корневых волосах время жизни флуоресценции на растущем кончике было ниже (3,6 ± 0,8 нс) по сравнению с плазматической мембраной нерастущих эпидермальных клеток (4,3 ± 0,6 нс). Изменение продолжительности жизни соответствует увеличению напряжения в кончике растущего корневого волоса, где кривизна мембраны наибольшая. Анализы плазмолиза в корневых волосах, окрашенных ротором, подтвердили чувствительность зонда к изменениям напряжения в тканях корня Arabidopsis, поскольку время жизни флуоресценции в кончиках корневых волос значительно увеличивалось при воздействии гиперосмотического стресса и снижении натяжения мембраны.